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評估NGS級別FFPE RNA質量還在看RIN值?

版權所有,轉載請聯系基因市場部
2019-08-23

對于普通RNA樣本質量評估,一般進行OD260/280檢測純度、Qubit檢測濃度、Agilent2100 檢測RNA Integrity Number(RIN)值評估完整度、電泳分析RNA降解程度等。但對于FFPE樣本,由于沒有統一的處理和儲存標準,過程中容易產生不同程度的核酸降解和損傷,同時RNA 比DNA更容易降解,上述傳統方法并不能完全恰當的評估提取的FFPE RNA樣本質量是否適合RNA-seq。


例如許多人用RIN值來判斷FFPE RNA樣本質量是否適合下游文庫構建。然而illumina 表示對于RNA文庫構建,RIN值并不能有效評估RNA樣本質量,因為相同RIN值的RNA樣本片段分布可以相差很大。如下圖用Agilent 2100 分析腫瘤組織FFPE樣本純化的RNA與標準Universal Human Reference(UHR)對比。可以看到這些樣本即使RIN值非常接近(<3.2),RNA 的片段大小分布也相差非常大,大多數樣本主要的RNA片段都小于200nt。

最近,基因有限公司獨家代理的Covaris 的科學家們探討了用于RNA-seq的FFPE RNA質量的具體評估指標,以期客觀評價NGS級FFPE RNA。Covaris 用Covaris truXTRAC? FFPE kit +AFA超聲(自動聚焦聲波技術)方法和用傳統手動抽提方法抽提來源于腎、肝臟、子宮的相同FFPE 樣本RNA。除使用上述DV200值外,還用Qubit RNA IQ值評估提取的FFPE RNA質量,更嚴格的用Functional RNA Quantitation (FRQ)值評估了提取的RNA樣本可擴增RNA量。

DV200值

illumina 推薦用大于200nt RNA片段所占比值即DV200值來評估用于illumina文庫構建的RNA樣本質量(見下表),DV200值小于30%的樣本不推薦用于文庫構建,隨著DV200值越高,RNA input量可以減少。

從下圖可以看出Covaris truXTRAC 提取的RNA DV200值顯著優于傳統Q廠家方法且DV200值均大于50%。

Figure 1: DV200 scores for both Covaris truXTRAC tNA Plus extraction kit and Competitor Q’s extraction kit, as measured by the Smear Analysis tool on the 2100 Bioanalyzer (200 to ~17,000 nt) for kidney, liver and uterus tissues (N=3 per tissue).

Qubit RNA IQ值

Qubit RNA IQ值基于簡單的雙染料檢測以獲取RNA質量及完整性數據。Qubit RNA IQ檢測是在Qubit4.0上配合Qubit RNA IQ試劑盒完成,使用了兩種獨特的染料—一種可特異性與大片段、完整性好或具有高級結構的RNA結合,而另一種可選擇性與小片段、降解的RNA進行結合。因此,二者相結合便可對RNA樣品的質量及完整性進行快速的評估。類似于其他RNA質量評分系統,RNA IQ#也會提供1-10的打分結果,而越大的IQ#則意味著樣品中存在著越多的大片段或具有高級結構的RNA。相反,越小的IQ值則意味著樣品中的RNA主要由小RNA或三級結構不完整的RNA所組成。

如下圖對比IQ值,Covaris truXTRAC 提取的RNA IQ值顯著優于傳統Q廠家方法。

Figure 2: Qubit RNA Integrity & Quality (IQ) Score using Covaris truXTRAC tNA Plus extraction kit compared to Competitor Q’s extraction kit for kidney, liver, and uterus
tissues (N = 3 per tissue).

FRQ值

Functional RNA Quantitation (FRQ) 值用于評估可擴增RNA的提取量。由于下游NGS應用包含幾個酶反應步驟,這對于input RNA樣本質量非常敏感。Thermo Fisher開發了基于RT-qPCR方法的FRQ值,是定量評價FFPE RNA的理想方法。在這一檢測中只有質量足以使酶反應的RNA才能被qPCR定量。Thermo Fisher認為FRQ評分<0.2ng/μl的樣品質量較差,容易建庫失敗或不能夠產生可靠的測序結果。

如下圖對比FRQ值, Covaris truXTRAC 提取的RNA FRQ值均大于0.2ng/μl,且顯著高于傳統Q廠家方法提取的FFPE RNA樣本。

Figure 3: Functional RNA Quantitation (FRQ) Score using Covaris truXTRAC tNA Plus extraction kit compared to Competitor Q’s extraction kit for kidney, liver and uterus tissues. Samples falling below the red dashed line (FRQ score of 0.2 ng/μl) are considered to be poor quality and likely to produce poor sequencing results.


用Covaris AFA超聲技術和Covaris truXTRAC FFPE tNA Plus Kit提取的RNA在三個獨立的RNA評估質量指標中均優于傳統Q廠家方法,幫助從FFPE樣本中獲得高質量RNA樣本,從而在診斷文庫中獲取更多信息:

嚴格的完整性和功能性RNA 評估用Functional RNA Quantitation (FRQ)值評估;
FFPE RNA 質量可以用電泳 (Bioanalyzer 2100) DV200值評估;
評估大片段、完整的FFPE RNA提取可以用熒光染料法Qubit IQ 值。

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參考文獻:

1. (2016). Evaluating RNA Quality from FFPE Samples.Illumina. 

2. (2017). Methodology for assessing quality of RNA from FFPE samples for the Oncomine Immune Response Research Assay. 

3. (2018). Qubit RNA IQ Assay: a fast and easy fluorometric RNA quality assessment. Thermo Fisher Scientific. 

4. Case Study: The ORIEN Project – Large Scale Integration of FFPE Material into a Multisite Research Alliance.

5. Ward PhD, Toby. The importance of proper formalin fixation of FFPE specimens. Personalis. 

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